Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) Übung

• Beschifte den Aufbau einer HPLC-Anlage.

  Tipps

  Bei der HPLC findet die Stofftrennung unter hohem Druck statt.

  Lösung

  Aus dem Lösemittelreservoir gelangt das Lösemittel in die Apparatur, in der die Pumpe einen hohen Druck aufbaut. Durch die Probenaufgabe gelangt das zu untersuchende Stoffgemisch in die Hochdruckapparatur und mischt sich mit dem Lösemittel.

  Die Lösung wird durch die Säule gepresst und das Stoffgemisch aufgetrennt.

  Detektor und Signalumwandler am Ende der Säule registrieren, wann gelöste Stoffe im Gemisch, das aus der Säule kommt, vorhanden sind und geben das Signal an den mV-Schreiber weiter. Hier wird das Signal als Peak im Chromatogramm sichtbar.

  Das Lösemittel wird in einem Abfallbehälter aufgefangen und gesammelt.

• Zeige die Unterschiede zwischen NP- und RP-HPLC auf.

  Tipps

  Häufig wird das als normal angesehen, was als Erstes entdeckt wurde.

  Ist die Stationäre polar, muss die mobile Phase unpolar sein, da sie sonst zu stark miteinander wechselwirken würden. Das würde die Trennleistung verschlechtern.

  Lösung

  Das Kieselgel, welches häufig bei chromatographischen Verfahren als stationäre Phase verwendet wird, besteht aus Siliciumdioxid, welches an der Außenseite viele Hydroxyl-Gruppen $(-OH)$ trägt. Diese Gruppen sind für den polaren Charakter der stationären Phase verantwortlich.

  Da dieses Material bereits seit langer Zeit verwendet wird, wurde es als normal angesehen.

  Bei Verwendung einer polaren stationären Phase muss ein unpolares Lösemittel als Eluent verwendet werden. Die Oberfläche des Kieselgels lässt sich jedoch auch mit unpolaren Molekülen beschichten, was die Verwendung von polaren Lösemitteln als mobile Phase möglich macht. Da die Polaritäten hier umgekehrt sind, wird dies als Umkehrphasen-Chromatographie (englisch: reverse phase) bezeichnet. Dies ist ein großer Vorteil, da sich viele Stoffe nicht in unpolaren Lösemitteln lösen und sich daher auch nicht mit Hilfe von chromatographischen Methoden, mit Kieselgel als stationärer Phase, analysiert werden können.

• Prüfe die Aussagen zur HPLC.

  Tipps

  Wird bei der NP-Chromatographie ein polares oder ein unpolares Lösemittel verwendet?

  Bei der Gaschromatographie werden sehr geringe Mengen der Probensubstanz verwendet.

  Lösung

  Die HPLC vereinigt Vorteile der Gas- und Säulenchromatographie in sich. Das Trennverfahren ähnelt dem der Säulenchromatographie. Daher können auch hier die analysierten Verbindungen durch Wechseln des Auffangbehälters zur richtigen Zeit voneinander getrennt werden.
  Da die Verbindungen nicht verdampft werden müssen, werden empfindliche Stoffe durch die HPLC nicht verändert oder zerstört. Außerdem können größere Mengen eingesetzt werden als bei der Gaschromatographie, was wünschenswert ist, wenn hinterher mit den gereinigten Substanzen weitergearbeitet werden soll. //

  Durch die kleinere Korngröße des Säulenmaterials wird eine größere aktive Oberfläche der stationären Phase erreicht. Zusätzlich kann so ein höherer Arbeitsdruck bei sinnvoller Durchflussrate erzielt werden. Dies führt im Vergleich zur Säulenchromatographie zu einer besseren Trennleistung, die sogar noch über der Trennleistung der Gaschromatographie liegt. Durch den hohen Druck ist die Methode weniger zeitintensiv als die Säulenchromatographie. //

  In biologischen Systemen ist meist Wasser das Lösemittel, daher sind biologisch wichtige Verbindungen häufig nicht gut in unpolaren Lösemitteln löslich. Um eine HPLC durchführen zu können, müssen die Verbindungen jedoch gelöst vorliegen. Daher muss häufig ein polares Lösemittel und dementsprechend eine unpolare stationäre Phase verwendet werden. Dafür kann die RP-HPLC genutzt werden.

• Analysiere ein HPLC-Chromatogramm.

  Tipps

  Je stärker die Adsorbtion an die stationäre Phase ist, desto länger dauert es, bis eine Verbindung durch die Säule gelaufen ist.

  Jede polare funktionelle Gruppe eines Moleküls kann mit der stationären Phase wechselwirken.

  Lösung

  Die Wechselwirkungen zwischen Molekülen, die Hydroxyl-Gruppen tragen, sind besonders hoch, da zwischen diesen Gruppen Wasserstoffbrückenbindungen entstehen können. Daher beeinflussen die Hydroxyl-Gruppen sehr stark die Adsorbtion einer Verbindung an das Kieselgel-Substrat.
  Je mehr $OH$-Gruppen ein Molekül trägt, desto mehr Wasserstoffbrückenbindungen kann es zur polaren stationären Phase ausbilden. Das Phloroglucin trägt drei $OH$-Gruppen und wird daher wesentlich stärker an das Kieselgel gebunden als die übrigen Verbindungen. Daher braucht es auch die längste Zeit, um durch die Säule zu wandern. Das zugehörige Signal im Chromatogramm liegt also ganz rechts.
  Das Phenol trägt immerhin eine Hydroxyl-Gruppe, daher braucht es deutlich länger als das Benzol, bis diese Verbindung den Detektor erreicht. Im Chromatogramm erscheint das Signal des Phenols daher rechts von dem des Benzols.

• Schildere den Unterschied zwischen HPCL und UHPLC.

  Tipps

  Bei HPLC und UHPLC können Stoffe mit hohem Siedepunkt problemlos analysiert werden.

  Lösung

  Bei der UHPLC – der ultra high performance chromatography – wird eine bessere Trennleistung erreicht als bei der normalen HPLC. Dies wird dadurch erreicht, dass das Material in der Säule eine geringere Korngröße aufweist. Dadurch ist die aktive Oberfläche der stationären Phase wesentlich höher und daher sind die Wechselwirkungen zwischen stationärer Phase und den zu trennenden Stoffen größer. Auch der Druck in der Apparatur ist mit bis zu 700 bar deutlich höher, was ebenfalls zu einer Verbesserung der Trennleistung führt.

• Beschreibe die Chromatogramme.

  Tipps

  Wie äußert sich eine zu große Wechselwirkung mit der stationären Phase?

  Starke Wechselwirkungen mit der mobilen Phase führen zu einer geringen Adsorption.

  Lösung

  Die untersuchten Verbindungen unterscheiden sich in der Anzahl der $OH-$Gruppen, es gilt: je mehr $OH-$Gruppen vorhanden sind, desto polarer ist die Verbindung. Bei Verwendung einer unpolaren stationären Phase (RP-HPLC) werden diejenigen Verbindungen am stärksten von der stationären Phase adsorbiert, die am wenigsten polar sind. Die polareren Verbindungen hingegen werden vom Lösemittel besser eluiert. Dies führt dazu, dass hier die polaren Verbindungen im Chromatogramm auf der Zeitachse weiter links erscheinen als die unpolaren Verbindungen. Das Chromatogramm ist also im Vergleich zum NP-Chromatogramm gespiegelt.

  Da bei den gezeigten Chromatogrammen die gleiche Probe verwendet wurde, lassen sich die Verbindungen den Signalen zusätzlich auch über die Intensität der Signale zuordnen. Hieran ist deutlich zu erkennen, dass das RP-Chromatogramm dem gespiegelten NP-Chromatogramm entspricht. //

  Wird bei der RP-Chromatographie dieser Probe eine zu unpolare stationäre Phase verwendet, ist das resultierende Chromatogramm unbrauchbar. Da alle drei Verbindungen, dank vorhandener $OH-$Gruppen, polaren Charakter haben, ist die Wechselwirkung mit der mobilen Phase bei allen Verbindungen deutlich stärker als mit der stationären Phase. Daher werden alle Verbindungen nur schwach von der stationären Phase adsorbiert und gelangen mit ähnlich hoher Geschwindigkeit durch die Säule. Im Chromatogramm äußert sich dies darin, dass die Signale aller Verbindungen zusammenfallen, es ist also nur ein großes Signal zu erkennen. Dieses liegt auf Grund der geringen Adsorption sehr weit links im Chromatogramm. Die Trennleistung ist also so gering, dass die Verbindungen nicht getrennt werden können. //

  Ähnlich ist es bei Verwendung eines zu unpolaren Lösemittels bei der NP-Chromatographie: Hier sind die Wechselwirkungen mit der mobilen Phase bei allen drei Verbindungen zu gering. Alle drei Verbindungen werden daher von der stationären Phase stark adsorbiert und gelangen nur langsam durch die Säule. Auch dies führt zu einer sehr geringen Trennleistung, was sich im Chromatogramm erkennen lässt. Da dieses Mal die Wechselwirkungen mit der stationären Phase groß sind, liegt das Signal sehr weit rechts auf der Zeitachse. //

  Bei Verwendung eines zu hohen Arbeitsdrucks läuft das Gemisch zu schnell durch die Säule. Bei Verwendung der richtigen Kombination von Eluent und Säulenmaterial ist die Trennleistung zwar hoch, jedoch liegen die Signale sehr nah beieinander und weit links auf der Zeitachse.